Inhibición de la formación de biopelículas de Candida Albicans mediante berberin

Candida albicans es un microorganismo simbiótico que se encuentra en la superficie mucosa de la mayoría de las personas sanas, pero puede causar infecciones sistémicas potencialmente mortales en personas inmunodeprimidas. La infección por C. albicans es el cuarto tipo más común de infección en medio hospitalario. 

Candida albicans es un hongo dimórfico, es decir, se desarrolla de forma distinta (en forma de levadura o bien en forma de hongo filamentoso (hifas)) en función del estado inmunitario del huésped, temperatura, disponibilidad de nutrientes etc.  y se reproduce de forma asexual por gemación.

En la forma de levadura presenta un aspecto de células redondas u ovaladas, de 3-8 x 2-7 micras de tamaño, agrupadas en pequeños grupos, mientras que, en forma de hongo filamentoso, las células se alargan y se diversifican tomando la apariencia de filamentos, pseudo-hifas o pseudo-micelio. Este dimorfismo le permite evadir los mecanismos de defensa relacionados con la inmunidad celular del huésped. En forma de levadura se comporta como saprófita, conviviendo en simbiosis con el huésped, mientras que, en forma de hongo filamentoso se comporta como un parásito patógeno produciendo síntomas en el huésped.

El desarrollo del organismo unicelular a hifas es un paso esencial en el desarrollo de biopelículas y se ve afectado por varios factores regulatorios. El factor de transcripción EFG1 juega un papel positivo en la regulación del tubo germinal/hifas y la formación de biopelículas. Su expresión aumentada puede activar rápidamente la expresión de genes que codifican a una serie de proteínas específicas para la formación del micelio (HWP1, ECE1, ALS1). 

La formación de biopelículas por C. albicans aumenta su virulencia y la resistencia a los medicamentos aplicados, por ello se buscan nuevos agentes antifúngicos naturales para poder controlar la infección por C. albicans y en especial, la formación de biopelículas. La berberina es un alcaloide del grupo de las isoquinolinas aislado de las plantas de la familia Berberis, la cual presenta una amplia variedad de acciones a nivel metabólico (glucosa, colesterol), además de efectos antiinflamatorios y antioxidantes.

Según investigaciones previas, se supone que la berberina puede actuar como antifúngico al inhibir la expresión de EFG1, HWP1, ECE1 y ALS1 (cuatro genes clave en la formación de hifas) y evitar la formación de biopelículas, pero faltan más datos. Por ello, el objetivo de este estudio, ha sido investigar esta hipótesis mediante diferentes pruebas in vitro que incluyen evaluar tres concentraciones diferentes (128 µg/ml, 32 µg/ml y 8 µg/ml) de berberina en la actividad celular, morfología, espesor y expresión de genes implicados en la biopelícula. La actividad de la berberina se compara con el fármaco de elección utilizado en la práctica clínica, el fluconazol (4 µg/ml).

Figura 1.- Dimorfismo de C. albicans y posible mecanismo de acción de la berberina sobre los genes clave de formación de hifas y biopelícula.

Cambios en la actividad celular de la biopelícula de C. albicans.

De las 3 concentraciones de berberina utilizadas (128 µg/ml, 32 µg/ml y 8 µg/ml), la concentración de 32 µg/ml mostró una actividad antifúngica significativa contra C. albicans (concentración mínima inhibitoria (CMI)). La concentración de fluconazol utilizada como patrón y con las que se obtuvo un resultado similar fue de 4 µg/ml. El efecto antifúngico de la berberina sobre la biopelícula temprana de C. albicans a las 6 h fue mejor que a las 4 h.

Efecto de la berberina sobre la morfología microscópica y el espesor de la biopelícula de C. albicans

La estructura y morfología tridimensional de la biopelícula se colapsó con 128 µg/ml y 32 µg/ml de berberina, igual que los 4 µg/ml del grupo fluconazol. El espesor de la biopelícula de los grupos de berberina de 128 µg/ml, 32 µg/ml y 8 µg/ml disminuyó significativamente.

Expresión de los genes EFG1, HWP1, ECE1 y ALS1 responsables de la formación de biopelículas 

En comparación con el grupo de control, 128 y 32 µg/ml de berberina pueden inhibir significativamente la expresión de los cuatro genes clave de la formación de biopelículas a las 4 y 6 h, mientras que 8 µg/ml de berberina no tuvieron una inhibición significativa. En comparación con los 4 µg/ml de fluconazol, los 128 µg/ml de berberina tuvieron un mejor efecto de inhibición de biopelículas y menor cantidad de células viables a las 4 h.

Existen pocos estudios sobre el efecto inhibidor de la berberina sobre biopelículas de C. albicans, principalmente sobre la transformación morfológica de las células, la viabilidad y arquitectura de C. albicans tratadas con berberina.

Se ha descubierto que la berberina tiene una buena actividad antifúngica contra la formación de biopelículas de C. albicans al reducir su espesor y alterar la estructura y células implicadas en la biopelícula.  El proceso de formación de biopelículas es complejo y se ve afectado por muchos factores, y la transformación fúngica del estado de levadura al estado micelial del C. albicans juega un papel importante. Se ha reportado que concentraciones más bajas de alizarina (2 µg/ml) y sanguinarina (0,8 µg/ml) inhiben el desarrollo de las hifas de C. albicans. En cambio, estudio encontró que la berberina mostró la misma actividad a 128 y 32 µg/ml y además, a 32 μg/ml destruyó la estructura de la biopelícula (a 128 μg/ml se rompió por completo). Los datos sugieren que la berberina puede suprimir el cambio dimórfico de C. albicans al inhibir el desarrollo de la biopelícula.

La transformación fúngica del estado de levadura al estado micelial de C. albicans se ve afectada por una variedad de factores reguladores, y el mecanismo de cambio de fenotipo podría estar relacionado con los cuatro genes clave de la vía de señalización Ras1-cAMP-EFG1. La expresión de EFG1 puede activar rápidamente la expresión de una serie de genes específicos de la formación de hifas, promoviendo así la formación de biopelículas. ECE1 y HWP1 son genes formadores de hifas, que no se expresan en estado de levadura, pero son abundantemente expresados en el estado micelial y su expresión está regulada por el factor de transcripción EFG1. Además, EFG1 también puede regular positivamente la expresión del gen ALS1 relacionado con la adhesión celular. ALS1 se expresa altamente durante la formación de biopelículas y la pérdida del gen ALS1 puede causar defectos graves en la biopelícula. Para aclarar aún más el mecanismo de acción de la berberina, este estudio investigó los cuatro genes clave de la formación de micelio después de la intervención con el fitoquímico. La expresión de genes reguladores clave en la formación de biopelículas disminuyó significativamente en el grupo de 128 y 32 µg/ml de la berberina. Por lo tanto, la berberina influye negativamente la expresión de genes reguladores clave en la formación de biopelículas para inhibir la formación y proliferación de hifas. Los resultados de este estudio son consistentes con hallazgos anteriores de que la alizarina reducía los niveles de transcripción de genes específicos de la formación de hifas como ECE1, HWP1 y el hinokitiol en la expresión de los genes HWP1 y ALS1.

El fluconazol es el primer fármaco antimicótico de elección. Inhibe la vía biosintética del ergosterol al atacar la lanosterol 14-a-desmetilasa, lo que produce defectos en la formación de la membrana celular y la inhibición del crecimiento de hongos. La combinación de berberina y fluconazol ha mostrado in vitro un efecto sinérgico sobre C. albicans resistente al fluconazol. La berberina tuvo un efecto antifúngico importante en el efecto sinérgico, mientras que fluconazol desempeñó un papel en el aumento de la concentración intracelular de la berberina, por lo que esta asociación tiene un valor potencial para la aplicación clínica. 

Huang X, Zheng M, Yi Y, Patel A, Song Z, Li Y. Inhibition of berberine hydrochloride on Candida albicans biofilm formation. Biotechnol Lett. 2020 Nov;42(11):2263-2269. doi: 10.1007/s10529-020-02938-6. Epub 2020 Jun 15. PMID: 32557120.